ЗАГРУЗКА
Навигация: » » » АСИТ мономерным аллергоидом из клещей домашней пыли

АСИТ мономерным аллергоидом из клещей домашней пыли

АСИТ мономерным аллергоидом из клещей домашней пыли

Аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ) является этиологически обоснованным, влияющим на все звенья аллергического процесса патогенетическим видом лечения аллергических болезней, которые достигли уровня пандемии в индустриально развитых странах, где заболеваемость населения составляет 20-30%. Использование АСИТ, примененной впервые в 1911 г., продолжает сталкиваться с проблемами безопасности и эффективности. Традиционная (инъекционная) АСИТ, основанная на использовании нативных аллергенных экстрактов, сопряжена с риском появления местных и системных реакций, причем последние часто носят угрожающий жизни характер, что может привести к фатальным последствиям. Поэтому пути усовершенствования АСИТ связаны с повышением ее безопасности и эффективности и направлены на разработку как новых подходов в создании гипоаллергенных препаратов, так и на внедрение в клиническую практику альтернативных путей введения аллергенных экстрактов (таких как сублингвальный, интраназальный, пероральный, накожный и др., а также включая комбинацию инъекционного и сублингвального путей введения).

В предыдущих исследованиях показана возможность химической модификации аллергенов методом сукцинилирования для получения мономерных аллергоидов с пониженной аллергенностью и сохраненной иммуногенностью, что в случае АСИТ этими аллергоидами приводит к переключению иммунного ответа организма на аллерген с Th2-зависимого на Th1-зависимый.

Одной из распространенных форм круглогодичной аллергии является аллергия к клещам домашней пыли, которой страдают во всем мире примерно 10-20% населения. Причем причинно-значимая роль клещей Dermatophagoides pteronyssinus и Dermatophagoides farinae в появлении симптомов атопических аллергических заболеваний хорошо установлена. Несколько контролируемых клинических исследований по изучению эффективности инъекционной и сублингвальной АСИТ при аллергии к клещам домашней пыли показали противоречивые результаты. Поэтому создание новых гипоаллергенных препаратов для лечения аллергии к клещам домашней пыли, основанных на новых подходах, крайне востребовано.

В предыдущем исследовании нами получен гипоаллергенный мономерный аллергоид из клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus, обладающий пониженной аллергенностью (способностью связывать аллерген-специфический IgE) и сохраненной (даже увеличенной) иммуногенностью (способностью индуцировать аллерген-специфический IgG1 и IgG2a).

Целью данного исследования было изучение эффективности экспериментальной аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) мономерным аллергоидом, полученным из аллергенного экстракта клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus (Der p), на мышиной модели аллергического ринита (АР).

Материалы и методы


Жидкий экстракт клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronussinius (D1), полученный из ФГБУ НИИВС им. И.И. Мечникова и произведенный согласно действующему лабораторному регламенту на основании патента RU 2331437 C1 (A61K39/35), после грубой и стерилизующей фильтрации был лиофилизирован, после чего часть высушенного экстракта D1 была модифицирована сукцинилированием (sD1), как описано ранее. Модифицированый Dermatophagoides pteronussinius (sD1) представлял собой мономерный аллергоид, хорошо растворимый в воде и физиологическом растворе.

Данные по экспериментальной АСИТ на модели экспериментального аллергического ринита с использованием мономерного аллергоида Dermatophagoides pteronussinius (sD1) получены с использованием самок мышей линии BALB/c, поставленных из питомника ГУНЦБМТ "Столбовая". Возраст мышей на момент начала эксперимента составлял 8 недель, а их масса тела колебалась в пределах 19-21 г. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом МЗСР РФ № 267 от 19.06.2003 г. "Правила лабораторной практики в Российской Федерации" и "Положением об этическом отношении к лабораторным животным ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России.

В течение эксперимента мыши находились в клетках для содержания лабораторных животных "клетки-стандарт Т-3" производства ООО "НПК Открытая наука" (Россия) на территории вивария ВОНЦ им. Н.Н. Блохина. Температура воздуха в виварии - 23 °С, относительная влажность - 40-60%, световой режим - (12:12 ч). Животным был обеспечен неограниченный доступ к воде (ГОСТ 2874-82 Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством) и полнорационному экструдированному комбикорму, рецепт ПК-120 для содержания лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков), сертификат соответствия № РОСС RU. ПР 98. В 01272, ГОСТ Р 51849-2001 Р.5 производства ООО "Лабораторкорм" (Россия). На этапе сенсибилизации производилось систематическое наблюдение за состоянием животных (еженедельный визуальный осмотр), на этапах проведения экспериментальной АСИТ и челленджирования проводился ежедневный осмотр.

Мыши были распределены на 5 групп (n=8 в группе) (рис. 1). 1-4-я группы иммунизировали внутрибрюшинно (в/б) в объеме 0,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) смесью 50 мкг/мышь (по белку) D1 и 2 мг Al(OH)3 трижды с интервалом 3 недели. 5-ю группу (отрицательный контроль) ложно иммунизировали 0,5 мл PBS. Экспериментальная АСИТ начиналась через десять дней после последней иммунизации, когда мышам вводили подкожно (п/к) D1 или sD1 в объеме 150 мкл PBS.

Схемы АСИТ для 1-5-й групп состояли в следующем (см. рис. 1): 1-я и 5-я группы получали ложную АСИТ PBS 16 раз через день; 2-я группа получала по 4 инъекции в возрастающих дозах D1 (1; 10; 100; 1000 мкг/мышь), всего 16 инъекций; 3-я группа получала инъекции sD1 в возрастающих дозах (три раза 100 мкг/мышь, два раза 550 мкг/мышь и три раза 1000 мкг/мышь), всего 8 инъекций с интервалом в три дня между инъекциями одной концентрации и с интервалом в пять дней перед повышением количества вводимого аллергоида; 4-я группа получала инъекции возрастающими дозами sD1 (один раз 100 мкг/мышь, два раза 550 мкг/мышь и один раз 1000 мкг/мышь) с трехдневным интервалом между инъекциями. Через 12 дней после последней инъекции животным 4-й группы начинали сублингвальное (с/л) введение sD1 по 1000 мкг/мышь в объеме 50 мкл PBS через день, всего 4 раза.

аллергия на клеща домашней пыли

Через 3 дня после окончания экспериментальной АСИТ мышей 1-4-й групп челленджировали интраназальнми аппликациями (ИНА) по 50 мкл/мышь D1 в концентрации 20 мг/мл (по белку) три дня подряд, после чего еще два дня подряд в концентрации 40 мг/мл (по белку). 5-я группа получала ИНА PBS.

Сразу после последнего челленджирования мышей проводили оценку проявлений клинических симптомов ринита (в частности чихания). Для этого после ИНА каждую мышь помещали в отдельную клетку, где в течение пяти минут производили подсчет актов чихания (учитывалось наличие характерного звука и движения головой). Для подсчета использовали "слепой метод" во избежание неосознанного искажения экспериментатором результатов.

Через 24 ч после последнего челленджирования оценивали частоту дыхания при помощи использования плетизмографа - двухкамерного прибора FinePointe NAM (Buxco, США). После настройки прибора и калибровки мышей разных групп помещали в специальные пластиковые камеры плетизмографа, состоящие из назальной и торакальной частей, после чего фиксировали. В небулайзер назальной части камеры вносили по 10 мкл раствора метахолина (Мх) в концентрациях 6,25; 12,5 и 25 мг/мл. В течение 3 минут работы прибора для каждой концентрации Мх с использованием программного обеспечения рассчитывали показатель f (частота дыхания), который анализировали по каждой точке (концентрации Мх) для каждой группы. Критерием эффективности модели аллергического ринита (1-я группа) было снижение показателя частоты дыхания мышей относительно группы отрицательного контроля (5-я группа), имеющей максимальные значения f, свидетельствующие о свободном (нормальном) воздушном потоке через носовую полость.

Забор крови у животных из ретроорбитального пространства для получения сывороток производили три раза: через 7 дней после последней иммунизации, за 1 день до челленджирования и через 24 ч после последнего челленджирования. Уровни анти-Der p IgE, IgG1, IgG2a в индивидуальных сыворотках определяли твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА), как описано ранее.

Через 48 ч после последнего челленджирования животных всех групп умерщвляли и проводили забор материала для гистологического исследования (голова целиком) с целью оценки гистологической картины выраженности аллергического ринита (АР) в носовой полости. Кратко: головы мышей после декапитации фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина. После этого проводили процедуру декальцинации костной ткани головы: голову целиком переносили в реагент для быстрой декальцинации костной ткани (J.T.BAKER, Decalcifier, Нидерланды) в соотношении объем ткани: объем реагента 1:20 на 6-8 ч при температуре 37 °С. Данный метод является модификацией метода декальцинации в соляной кислоте, описанного ранее.

Затем препаровальной иглой определяли качество декальцинации по мягкости плоских костей черепа путем прокола в нескольких местах. При полном размягчении костей черепа скальпелем проводили фронтальный разрез лицевого отдела черепа в области лунок верхних резцов и вырезали образцы ткани во фронтальной плоскости толщиной 3-5 мм, которые проводили, используя метод обработки в спирт-хлороформе, заливали в парафин, готовили гистологические срезы толщиной 3-5 мкм, окрашивали гематоксилин-эозином. При этом срезы готовили в направлении на голове: ростральном - к носу и каудальном - по направлению к затылку. Микроскопирование препаратов осуществляли при увеличении ×400.

Для полуколичественной оценки гистологических изменений использовали модифицированную шкалу (в баллах), основанную на данных Ennis и соавторов:
  1. Общая картина воспаления носовой полости: 0 баллов - отсутствует; 1 балл - слабо выраженная картина воспаления; 2 балла - умеренно выраженная картина воспаления; 3 балла - сильно выраженная картина воспаления.
  2. Слизистая экссудация в носовой полости: 0 баллов - отсутствует; 1 балл - слабо выраженная (без клеток воспаления); 2 балла - умеренно выраженная (с наличием в составе экссудата умеренного количества клеток воспаления - полинуклеарных лейкоцитов); 3 балла - сильно выраженная (наличие в составе экссудата большого количества клеток воспаления - полинуклеарных лейкоцитов и макрофагов).
  3. Гиперплазия слизистой оболочки носовой полости: 0 баллов - отсутствует; 1 балл - умеренное увеличение количества бокаловидных клеток и умеренное увеличение высоты эпителиального слоя; 2 балла - выраженное увеличение количества бокаловидных клеток и выраженное увеличение высоты эпителиального слоя.

Результаты и обсуждение


До начала АСИТ состояние животных во всех группах было одинаковым, то есть не отмечались какие-либо патологические проявления. Однако во 2-й группе после второго введения 1000 мкг/мышь Dermatophagoides pteronussinius (D1) (78-й день эксперимента) отмечены местные реакции: выпадение шерсти в области инъекций и наличие уплотнения. На 80-й день у 50% мышей отмечены элементы изъязвления в области инъекции, причем этот показатель повышался до 75% на 82-й день. У животных остальных групп подобных проявлений отмечено не было. В то же время во время проведения челленджирования у мышей модельной группы (1-я группа) наблюдались слабо выраженные системные анафилактические реакции (боковое положение, характерное взъерошивание шерсти, отек мордочки).

После последнего челленджирования отмечено, что при всех трех вариантах АСИТ во 2-4-й группах существенно снижалось проявление клинических признаков (по результатам подсчета актов чихания) (рис. 2 а). Причем наибольшее снижение количества актов чихания отмечено у животных 3-й группы, получавших мономерный аллергоид sD1. При инструментальной оценке клинических проявлений экспериментального ринита методом неинвазивной плетизмографии было выяснено, что в группах у животных, подвергавшихся ИНА экстрактом Dermatophagoides pteronussinius (D1), заметно снижалась частота дыхания (рис. 2 б). Стоит отметить тот факт, что, несмотря на отсутствие улучшений по данному показателю в 3-й группе (АСИТ sD1), количество дыхательных актов в минуту у животных 2-й и 4-й групп (АСИТ соответственно D1 и sD1 - комбинированное п/к и с/л введение) было достоверно выше такового в 1-й группе (модель МАР).

клещи домашней пыли как избавиться

При оценке анти-Der p IgE было выявлено, что после третьей иммунизации уровень аллерген-специфического IgE возрастал в 1-4-й группах (рис. 3). После завершения АСИТ уровни анти-Der p IgE во 2-й, 3-й и 4-й группах повышались как относительно 5-й группы (отрицательный контроль), так и относительно 1-й группы (положительный контроль - модель аллергического ринита (АР)).

Однако после проведения челленджирования наивысшие уровни анти-Der p IgE отмечались в 1-й и 4-й группах, в то время как в 3-й группе отмечалась тенденция к снижению, а во 2-й группе уровень анти-Der p IgE был существенно понижен в сравнении с 1-й группой. Относительно уровней анти-Der p IgG1 можно отметить устойчивое, статистически достоверное повышение во 2-й, 3-й и 4-й группах, получавших АСИТ, которое сохранялось и после челленджирования (рис. 4). Уровни анти-Der p IgG2a демонстрировали тенденцию к увеличению после АСИТ, которая была наиболее выражена в 3-й и 4-й группах, причем после челленджирования уровень анти-Der p IgG2a в 4-й группе был достоверно выше такового 1-й группы (рис. 5).

лечение ринита методом асит

При гистологической оценке общая картина воспаления, слизистая экссудация, гиперплазия слизистой оболочки были существенно более выражены в 1-й и 2-й группах по сравнению с группой отрицательного контроля (5-я группа). В то же время во 2-й группе наблюдалась тенденция к снижению вышеназванных показателей. Вместе с тем в 3-й и 4-й группах (АСИТ sD1 и комбинированная п/к и с/л АСИТ sD1) наблюдалось полное подавление этих показателей (рис. 6).

Таким образом, экспериментальная АСИТ во 2-й, 3-й и 4-й группах приводила к выраженному снижению морфологической манифестации аллергического ринита (АР), что определялось снижением степени деструктивных процессов в эпителии носовой полости. По суммарной выраженности лечебного эффекта экспериментальной АСИТ группы можно расположить в следующем порядке 4-я и 3-я группы > 2-я группа.

аллерген dermatophagoides pteronyssinus

В предыдущих исследованиях нами показано, что экстракт из клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus (D1), химически модифицированный сукцинилированием e-групп лизина и превращенный таким образом в мономерный аллергоид (sD1), обладал существенно меньшей аллергенностью по сравнению с немодифицированным экстрактом (D1). В то же время полученный мономерный аллергоид sD1 продолжал демонстрировать выраженную иммуногенность. При иммунизации мышей мономерным аллергоидом sD1 не отмечалось усиление продукции анти-Der r IgE, однако наблюдалось существенное возрастание анти-Der p IgG1 и IgG2a антительного ответа. Это обстоятельство позволило в данной работе в начальной фазе экспериментальной АСИТ аллергоидом sD1 (3-я, 4-я группы) использовать дозы значительно выше тех, которые применялись при АСИТ немодифицированным D1 (2-я группа), что позволило существенно сократить число инъекций. В результате мы получили некоторое снижение после челленджирования уровней анти-Der p IgE и существенное увеличение анти-Der p IgG1 и IgG2a антительного ответа.

В данной работе нами была поставлена цель - оценить эффективность экспериментальной АСИТ мономерным аллергоидом sD1 на мышиной модели аллергического ринита. Нами было предложено несколько вариантов проведения АСИТ на модели ринита: инъекционное (подкожное) введение немодифицированного (нативного экстракта) D1, подкожное введение модифицированного sD1 (мономерного аллергоида) и комбинированный вариант - подкожное и сублингвальное введение sD1. Результаты АСИТ мономерным аллергоидом sD1 сравнивали с группой, получавшей АСИТ нативным экстрактом D1 по схеме, предложенной ранее и являющейся экспериментальным аналогом "полуускоренной" схемы (semirush allergen immunotherapy protocol), часто используемой у человека при проведении "классической" инъекционной (подкожной) АСИТ. Парадоксально, но факт, что традиционная ("классическая") инъекционная АСИТ аллергенными экстрактами, практикуемая уже более 100 лет, до сих пор используется как "золотой стандарт" при оценке новых препаратов, предназначенных для усовершенствования этого вида лечения.

Моделирование ринита проводилось нами экстрактом Dermatophagoides pteronyssinus (D1) и включало трехкратную иммунизацию и пятикратное челленджировние выполнением ИНА, что приводило к проявлению признаков аллергического ринита (АР): наличие немедленной фазы аллергической реакции после контакта с аллергеном (подсчет актов чихания у мышей) и заложенности носа (оценка частоты дыхания). В дальнейшем также оценивались уровни содержания антител в сыворотках крови и наличие гистологических изменений в слизистой оболочке носовой полости, что в сумме позволяет использовать полученные данные для оценки эффективности проведения АСИТ модифицированным клещевым экстрактом. Подсчет частоты чихания у мышей хотя и субъективный, но полезный метод измерения, особенно для тестирования влияния проводимой терапии на механизмы ранней стадии аллергического процесса, например, на высвобождение гистамина. Использованная нами оценка частоты дыхания не является широко распространенным методом (из-за недостаточной распространенности современных неинвазивных плетизмографов), однако известно, что этот показатель хорошо коррелирует с гистаминзависимым ответом и считается аналогичным заложенности носа у человека.

аллерген dermatophagoides farinae d2

Снижение частоты клинических проявлений - один из важных критериев улучшения состояния при аллергическом рините (АР), и полученные нами данные согласуются с общемировой практикой подобных исследований на мышиных моделях АР. Второй важный аспект, обнаруженный в данном исследовании, это снижение уровня аллерген-специфического IgE и повышение аллерген-специфического IgG1 и IgG2a после инъекционной АСИТ мономерным аллергоидом sD1, что коррелирует с подавлением выраженности клинических симптомов. Это положение согласуется с литературными данными по АСИТ модифицированными аллергенами.

Однако в наших экспериментах мы не обнаружили существенного снижения уровня антител изотипа IgE, особенно после челленджирования, в группе (4-я группа), которая получала комбинированную АСИТ sD1 (инъекционную и сублингвальную), что возможно из-за недостаточной дозы sD1 при сублингвальном введении. Считается, что сублингвальная доза должна существенно (в разы) превышать инъекционную дозу при возможно длительном применении. В работе Rask и соавторов приводятся данные, свидетельствующие о том, что наибольшая эффективность сублингвальных препаратов отмечена при длительном ежедневном их введении. Несмотря на отсутствие снижения IgE у мышей 4-й группы, получавших АСИТ аллергоидом sD1 по комбинированной схеме, у них не наблюдались гистологические признаки воспаления носовой полости, что считается показателем улучшения в аналогичных экспериментальных работах.

dermatophagoides pteronyssinus dermatophagoides farinae

Считается, что аллергический ринит (АР) и астма не являются типичными проявлениями для животных. Так как у многих видов животных аллергическая реакция явно проявляется только на поверхности кожных покровов и слизистых, то, возможно, заболевания дыхательных путей играют у животных скорее триггерную роль в развитии дерматита. Однако специальными методическими приемами удалось воспроизвести на определенных видах млекопитающих признаки патологии, наблюдаемой у человека при рините и астме, причем ввиду наличия видовых особенностей набор этих признаков у разных представителей млекопитающих будет свой. Такие модели крайне необходимы для доклинического изучения безопасности и эффективности новых противоаллергических средств, включая те, которые разрабатываются для аллерген-специфической иммунотерапии.

Одной из важнейших характеристик любого лекарственного средства является его безопасность. У препаратов аллергоидов она прежде всего обеспечивается сниженной аллергенностью, то есть неспособностью модифицированного аллергена связывать аллерген-специфический IgE на поверхности клеток-мишеней аллергии (в основном тучных клеток и базофилов) и запускать каскад аллергических реакций. Следует отметить тот факт, что используемые аллергенные экстракты вызывают местные и системные побочные реакции. Так, по данным Nacaroglu и соавторов, местные побочные реакции при инъекционной АСИТ нативными аллергенными экстрактами составляли 0,38%, а системные - 0,1% (на 14 308 инъекций), причем местные реакции наблюдались в основном в фазе наращивания дозы, тогда как системные - при поддерживающей дозе.

Кроме того, отмечено, что побочные реакции чаще наблюдались у пациентов, получавших АСИТ аллерговакцинами из клещей домашней пыли, содержащими несколько компонентов аллергенных экстрактов. Вместе с тем, по данным Американской академии аллергии, астмы и иммунологии (American Academy of Allergy, Asthma and Immunology) и Американского колледжа астмы, аллергии и иммунологии (American College of Asthma, Allergy and Immunology), в период с 2008-го по 2013 г. зарегистрированы 4 смертельных случая от АСИТ на 28 млн инъекций. Общий процент системных реакций при инъекционной АСИТ составил 1,9%, тогда как при сублингвальной АСИТ - 1,4%. Приведенные данные по побочным реакциям при АСИТ свидетельствуют о том, что разработка новых безопасных и эффективных аллерговакцин более чем востребована.

В данном исследовании мы наблюдали местные побочные реакции при подкожном введении высоких доз нативного экстракта Dermatophagoides pteronyssinus D1 во 2-й группе, получавшей АСИТ немодифицированным D1. В то же время в 3-й и 4-й группах, получавших инъекции мономерного аллергоида sD1, не отмечено ни местных, ни системных реакций на всем протяжении курса АСИТ. Это свидетельствует о преимуществе аллергоидной формы перед нативным аллергенным экстрактом с точки зрения безопасности. Кроме этого, преимущество мономерного аллергоида заключается также и в его эффективности, которая достигается меньшим числом инъекций.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что АСИТ мономерным аллергоидом из клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus, полученным методом сукцинилирования, может быть эффективным и безопасным подходом к терапии аллергического ринита, включая проведение комбинированного курса инъекционной и сублингвальной АСИТ, что может повысить эффект лечения и в конечном счете - качество жизни пациентов.

© А.А. Ласкин, А.А. Бабахин, О.Ю. Камышников, И.С. Гущин, М.Р. Хаитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, г. Москва



Похожие статьи

( 0 ) Комментарии

Комментарии к данной статье отсутствуют. Вы можете стать первым. Оставьте свое мнение!

Задайте вопрос, поделитесь своим опытом

Кликните на изображение чтобы обновить код, если он неразборчив