Осложнения бронхиальной астмы вызванные ОРВИ

Бронхиальная астма (БА) - хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, которое запускается несколькими патофизиологическими механизмами, приводящими к рецидивирующим приступам сужения бронхов и структурным изменениям дыхательных путей. К наиболее характерным клиническим признакам заболевания относят эпизодическую одышку, хрипы, спазм бронхов и затрудненный вдох. Около 70-80% всех случаев заболевания имеют аллергическую природу, характеризующуюся повышенным уровнем общего IgE и аллерген-специфических IgE в сыворотке крови, а также высоким содержанием эозинофилов в крови, слизистых оболочках дыхательных путей и в бронхо-альвеолярном лаваже (БАЛ).

Бронхиальная астма (БА) является одним из самых распространенных хронических заболеваний дыхательных путей с высокой смертностью до 250 тыс. человек в год и приводит к существенным экономическим потерям. Затраты стран Евросоюза на борьбу с этим заболеванием составляют 17,7 млрд евро, а в США - 18 млрд долларов ежегодно.

Считается, что острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), вызванные такими патогенами, как респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), риновирусы (РВ), метапневмовирус, вирусы парагриппа, коронавирусы и вирусы гриппа, являются основными триггерами развития бронхиальной астмы и ее осложнений. При этом наиболее "астмогенными" вирусами считаются респираторно-синцитиальный вирус и риновирусы группы С.

У большинства взрослых РСВ-инфекция вызывает лишь симптомы простуды, часто неотличимые от других респираторных заболеваний. Однако у детей раннего возраста респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) вызывает более тяжелые последствия, вплоть до летального исхода. Более того, перенесенная инфекция не вызывает стойкого иммунитета, что приводит к реинфекциям: более половины детей, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом в первый год жизни, повторно заражаются по крайней мере один раз в два-три года. Показано, что РСВ-инфекция, перенесенная в раннем детском возрасте, приводит к развитию бронхиальной астмы в дальнейшем. Позднее была продемонстрирована аналогичная способность риновирусной инфекции выступать в качестве фактора риска при развитии бронхиальной астмы.

Однако триггерный эффект респираторных инфекций подтверждался не во всех исследованиях. Например, Штейн с соавторами показали, что респираторно-синцитиальная вирусная инфекция, перенесенная в возрасте до трех лет, связана с развитием астмы в период до 11-летнего возраста, но не в более старшем возрасте. Томсен с соавторами не выявили связи между РСВ-инфекцией и развитием астмы при анализе реестра близнецов в Дании. Проведенное исследование позволило сделать вывод, что тяжелая респираторно-синцитиальная вирусная инфекция сама по себе не вызывает бронхиальную астму, но существует генетическая предрасположенность к совместному развитию обеих патологий.

Кроме того, существует так называемая "гигиеническая гипотеза" заключающаяся в том, что бактериальные и вирусные инфекции, включая ОРВИ, перенесенные в раннем возрасте, являются "защитой" от последующего развития аллергических заболеваний и астмы. Это подтверждается наблюдениями о более низкой распространенности аллергии и бронхиальной астмы у детей, посещающих детский сад или имеющих старших братьев/сестер. Предполагается, что протективное действие в этих случаях связано с более частыми инфекциями и, как следствие, формированием защитного иммунитета Th1-типа.

Таким образом, триггерный эффект ОРВИ при развитии БА у взрослых не доказан, тогда как способность респираторных вирусов вызывать осложнения у пациентов с бронхиальной астмой подтверждена рядом исследователей. Исследования клинического материала показывают, что респираторные вирусы синергически повышают частоту развития обострений бронхиальной астмы, часто приводя к летальному исходу. В частности, в 1995 г. Джонстон с соавторами исследовали образцы, полученные из дыхательных путей больных астмой детей на начальных этапах инфекции или при обострении астмы. Они установили, что вирусная инфекция обнаруживается в 85% случаев обострений БА, и примерно две трети всех случаев обострений связаны с риновирусной инфекцией. Подобная взаимосвязь ОРВИ и частоты обострений бронхиальной астмы подтверждена и у взрослых.

Несмотря на то что наиболее частой причиной осложнений бронхиальной астмы является риновирусная инфекция, респираторно-синцитиальная вирусная инфекция также вносит существенный вклад в данную патологию и может обеспечивать ее более тяжелое течение. У пациентов с бронхиальной астмой ввиду профилированности иммунного ответа в сторону Th2-типа вирус способствует усилению воспаления и повреждения тканей дыхательных путей. Повреждение цилиндрического мерцательного эпителия способствует поступлению аллергенов в дыхательный тракт, а высвобождение медиаторов воспаления в ответ на действие вируса - ускоренному и более тяжелому развитию воспалительной реакции.

Указанные выше исследования повлияли на изучение роли ОРВИ в развитии осложнений бронхиальной астмы с целью создания новых способов терапии. Для детального изучения молекулярных механизмов вирус-индуцированных осложнений бронхиальной астмы требуется использование экспериментальных воспроизводимых на мышах моделей.

На сегодняшний день остается важным установить, как и при каких условиях респираторная инфекция может спровоцировать осложнения астмы. В рамках данного исследования изучено изменение Th1/Th2-баланса с использованием на мышах модели респираторно-синцитиальных вирусно-индуцированных осложнений бронхиальной астмы.

Материалы и методы исследования

Животные и штамм вируса. Исследование проводилось на самках мышей BALB/с, в возрасте 6-8 недель, массой тела 20-22 г, полученных из питомника Российской академии наук "Столбовая" (Московская область, Россия). Экспериментальные процедуры проводили в соответствии с нормами по работе с лабораторными животными. Для заражения использовали культуру респираторно-синцитиального вируса (РСВ) штамм А2, предоставленную ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.

Протокол эксперимента. Экспериментальные животные были поделены на 4 группы по 10 мышей. Первым двум группам моделировали экспериментальную бронхиальную астму. Для этого проводили сенсибилизацию в дни 0, 14- и 27-й эксперимента путем внутрибрюшинных (в/б) инъекций овальбумина (OVA) в смеси с гидроокисью алюминия и в последующем, в 40-42-й дни, проводили интраназальные (и/н) провокации OVA в дозе 500 мкг/мышь в объеме 50 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Вторую группу дополнительно и/н инфицировали респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ) А2 в дозе 5×105 ТЦД50/мышь на 38-й день эксперимента. Третья группа получала только вирус. Четвертая группа никаким манипуляциям не подвергалась (рис. 1 А). Далее проводили сбор материала и анализ образцов.


Измерение гиперреактивности бронхов (ГРБ). Через 24 ч после последней провокации (на 43-й день эксперимента) регистрировали изменения гиперчувствительности бронхов в ответ на возрастающие концентрации метахолина [Sigma, USA] (6,25; 12,5 и 25 мг/мл) методом неинвазивной плетизмографии с использованием прибора FinePoint NAM (Non Invasive Airway Mechanics, Buxco Electronics, Inc., USA). Для оценки гиперреактивности бронхов (ГРБ) использовали показатель удельной сопротивляемости бронхов (sRaw - specific resistance of the airways), которая измеряется в cmH2O×s×ml-1.

Определение уровня аллерген-специфических антител. Через 24 ч после последней провокации осуществляли забор крови из ретроорбитального синуса. Сыворотку крови получали центрифугированием и хранили при - 70 °С. Уровни OVA-специфических антител изотипов IgE, IgG1 и IgG2a измеряли в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов (BD OptEIA) в соответствии с рекомендациями производителя. Планшеты покрывали OVA в концентрации 5 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при +4 °С перед началом испытаний.

Исследование клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ). Через 48 ч после последней провокации мышей умерщвляли и проводили сбор бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) промыванием легких средой RPMI1640 с добавлением 10% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка), 300 г/л L-глутамина и 0,6 мМ ЭДТА. Общее количество клеток оценивали на гемоцитометре (Abacus Junior Vet, DIATRON), после чего центрифугировали суспензию в течение 10 мин при 400 g и фиксировали клетки на предметном стекле. Идентификацию клеток проводили при помощи использования световой микроскопии после окрашивания азуром и эозином.


Гистологический анализ. Левую долю легкого фиксировали в 4% формалине. Срезы легких (4 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином для гистологической оценки и мониторинга воспалительных клеток. Гистопатологические изменения классифицировали в соответствии с модифицированной полуколичественной балльной системой: отсутствие признака (0), мягкий (1.0), умеренный (2.0) или тяжелый (3.0).

Определение уровня экспрессии целевых генов и вирусной РНК в ткани легких. Для проведения количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали правую долю легкого. Общую РНК выделяли из гомогенатов ткани легких с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen), после чего методом обратной транскрипции получали комплементарную ДНК (кДНК) с использованием случайных гексамерных праймеров и коммерческого набора (Синтол). Полученную кДНК амплифицировали с использованием ПЦР в реальном времени, оборудования iCycleriQ (Bio-Rad Laboratories) и специфических праймеров и зондов (см. таблицу).

Развитие осложнений бронхиальной астмы после инфицирования респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ)

Развитие инфекционного процесса у экспериментальных животных. Первым признаком, свидетельствующим о развитии инфекции у животных, является резкое падение массы тела после инфицирования. У мышей, интраназально инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ) А2, на 38-й день (группы 2 и 3) наблюдалось статистически значимое снижение массы тела на 9 и 15% соответственно, что свидетельствует о развитии продуктивной инфекции у данных животных (рис. 1 Б). Помимо этого для подтверждения наличия вирусной репликации в ткани легких оценивали количество копий вРНК методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая обнаруживалась только у инфицированных мышей (группы 2 и 3) в количестве 5 и 15×108 копий на 1 г ткани легкого соответственно (рис. 1 В).


Развитие аллергического процесса у экспериментальных животных. Значительную роль в патогенезе бронхиальной астмы играют аллерген-специфические антитела изотипов IgE и IgG1. У мышей 1- и 2-й групп, подвергшихся моделированию экспериментальной БА, был значительно повышен уровень аллерген-специфических IgE и IgG1, что указывает на наличие выраженной сенсибилизации к аллергену. В то же время в сыворотке крови животных 3- и 4-й групп аллерген-специфические антитела не детектировались. Помимо этого был изучен уровень аллерген-специфических IgG2a в сыворотке крови, которые являются маркерами Th1-ответа. Показано, что уровни сывороточных антител изотипов как IgE, IgG1, так и IgG2a были сходными у групп 1 и 2 (рис. 2 А).

Одним из самых важных клинических признаков бронхиальной астмы является повышенная гиперреактивность бронхов в ответ на раздражители. Измерение гиперреактивности бронхов у экспериментальных животных показало, что в группах, подвергшихся моделированию экспериментальной бронхиальной астмой, этот показатель был наиболее выраженным (увеличение гиперреактивности бронхов в 2,1 раза по сравнению с интактными животными). У животных, получавших только респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), гиперреактивность бронхов (ГБР) повышалась, но в меньшей степени (в 1,4 раза в сравнении с интактными животными). В то же время мыши, инфицированные РСВ, на фоне аллергического воспаления в легких, демонстрировали промежуточные значения ГБР (в 1,8 раза выше, чем у интактных животных) (рис. 2 Б).


В нашем исследовании показано увеличение общей клеточности бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ), которое отмечалось в группах 1, 2 и 3. Также изменился качественный состав инфильтрирующих клеток: у животных 1-й группы, подвергшейся моделированию экспериментальной БА, в БАЛ преимущественно детектировались эозинофилы, в то время как при РСВ-инфекции (3-я группа) в БАЛ обнаруживались лимфоциты и макрофаги. Важно отметить, что 2-я группа, у которой моделировались вирус-индуцированные осложнения бронхиальной астмы, показала комбинированный лимфоцитарный/ эозинофильный тип воспаления (рис. 3). Данные гистологического анализа в целом подтвердили картину, наблюдаемую в бронхо-альвеолярном лаваже (БАЛ). (рис. 4).


Изменения Th1/Th2-баланса. Исследование уровней сывороточных антител свидетельствует об отсутствии влияния респираторно-синцитиальной вирусной (РСВ) -инфекции на системный Th1/Th2-баланс сенсибилизированных к аллергену мышей. Дополнительно мы изучили локальное изменение Th1/Th2-баланса в ткани легких методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве маркеров Th2-иммунного ответа был выбран IL-4 как ключевой цитокин, экспрессирующийся Th2-клетками, и траскрипционный фактор GATA3, обеспечивающий поляризацию дифференцировки Th0-клеток в Th2-клетки. Соответственно в качестве маркеров Th1-имунного ответа были выбраны цитокин IFN-y и транскрипционный фактор T-bet.


Известно, что IL-4 играет важную роль при индукции аллергического иммунного ответа. В настоящем исследовании показано увеличение экспрессии гена данного цитокина в 1,4 и 1,6 раза в группах, подвергшихся моделированию бронхиальной астмы (группы 1 и 2), в сравнении с интактными животными и мышами, получавшими только респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) (рис. 5 А). Также отмечается тенденция к росту уровня экспрессии GATA3 в 1- и 2-й группах (рис. 5 Г). При этом происходит рост экспрессии IFN-y во 2- и 3-й группах, инфицированных РСВ, в 3,2 и 2,3 раза в сравнении с интактными животными (рис. 5 В). Экспрессия фактора T-bet, являющегося регулятором поляризации Th0-клеток в Th1-клетки, также увеличивается во 2- и 3-й группах (увеличение в 4 и 2 раза в сравнении с интактными животными) (рис. 5 Б).

Обсуждение вирус-индуцированных осложнений бронхиальной астмы

Модели, воспроизводимые на мышах, являются важным инструментом для исследований молекулярных механизмов патологических процессов человека, включая бронхиальную астму и респираторные вирусные инфекции. В настоящее время существует целый ряд разработанных протоколов, использующих различные аллергены, дозы и пути введения. Модели аллергических заболеваний, воспроизводимые на мышах, обладают рядом преимуществ перед другими, поскольку мыши являются наиболее полно охарактеризованными животными по иммунологическим показателям и в распоряжении исследователей имеется большой спектр реагентов для проведения анализа на специфические факторы.

При использовании мышей для изучения патогенеза вирусных заболеваний необходимо учитывать восприимчивость данного вида к вирусу и возможность перенесения полученных данных на человека. Мыши слабовосприимчивы к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ) человека. Поэтому для воспроизведения инфекции используют высокие дозы, около 105-106 TCID50/ мышь. В данном протоколе применялась доза 5×106 TCID50/мышь вируса РСВ штамма А2, который был очищен от культуральной среды и сконцентрирован. Очистка вируса от культуральной среды, содержащей в своем составе различные факторы роста и цитокины, позволяет получить более достоверные данные при исследовании на мышах.

Исследование вирус-индуцированных осложнений бронхиальной астмы на мышиной модели требует подтверждения как наличия продуктивной вирусной инфекции, так и развития аллергического воспаления в легких. Важным признаком, свидетельствующим о наличии инфекции, является снижение массы тела мышей после вызванной вирусом инфекции, что и было продемонстрировано на данной модели (падение массы тела до 15%). При этом неинфицированные мыши с бронхиальной астмой демонстрировали незначительное колебание массы тела за аналогичный период времени (в пределах 2%) (см. рис. 1 Б).

Еще одним доказательством инфекционного процесса является наличие вирусной РНК в легких. Методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров и зонда было показано наличие значительного количества вРНК в гомогенатах легких мышей 2- и 3-й групп, получавших вирус (рис. 1 В). Кроме того, для подтверждения жизнеспособности вируса в дыхательных путях были сделаны посевы бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) на культуре чувствительных к вирусу клеток (культура МА-104). Через 4-5 суток после посевов вирус проявил свой цитопатический эффект (данные не представлены), что подтвердило наличие инфекционного процесса у животных во 2- и 3-й группах.

Развитие аллергического воспаления у экспериментальных животных 1- и 2-й групп, сенсибилизированных к овальбумину, подтверждено различными методами. Во-первых, у животных из данных групп показано наличие аллерген-специфических IgE в сыворотке крови. Известно, что антитела изотипа IgE играют значительную роль в патогенезе аллергической бронхиальной астмы, связываясь с рецептором Fc RI на тучных клетках и базофилах, они способствуют их дегрануляции и высвобождению медиаторов воспаления, включая гистамин и лейкотриены, что является одним из пусковых механизмов развития воспаления бронхоконстрикции.


У животных, получавших только вирус, и интактных мышей аллерген-специфические IgE не детектировались. Известно, что не только антитела изотипа IgE способны опосредовать анафилактические реакции и вызывать нарушения функции дыхания. Мыши, дефектные по гену C-эпсилон константной цепи IgE и не продуцирующие антитела данного класса, способны развивать аллергический ответ на антиген. По всей видимости, при отсутствии IgE его роль выполняли антитела изотипа IgG1, концентрация которых в сыворотке крови также была повышена у экспериментальных животных из 1- и 2-й групп. Помимо этого был изучен уровень аллерген-специфических IgG2a в сыворотке крови, которые являются маркерами Th1-ответа. Их уровень также повышался у сенсибилизированных групп животных. Следует отметить, что уровни сывороточных аллерген-специфических антител изотипов IgE, IgG1 и IgG2a в 1- и 2-й группах были сходными, что свидетельствует об отсутствии влияния респираторно-синцитиального вируса (РСВ) на системный Th1/Th2-баланс у животных, сенсибилизированных к аллергену.

Другим важным признаком бронхиальной астмы является гиперреактивность бронхов (ГБР), которая развивается по IgE-зависимому механизму. Результатами данного исследования показано наличие выраженной ГРБ у животных 1- и 2-й групп, которые были иммунизированы аллергеном и у которых был подтвержден высокий уровень аллерген-специфических IgE. Несмотря на отсутствие аллерген-специфических IgE в сыворотке, животные, инфицированные только РСВ, также развивали ГРБ. Аналогичные результаты получены в работе Макела с соавторами. Рост гиперреактивности бронхов (ГБР) при респираторно-синцитиальный вирусной (РСВ) инфекции связывают с гиперпродукцией Th1-цитокина IFN-y, который в высокой концентрации способен выступать в качестве провоспалительного фактора, а также с инфильтрацией провоспалительными клетками ткани легких, такими как макрофаги и лимфоциты, в ответ на инфекцию, что и было показано в данном исследовании (см. рис. 3). Тем не менее, аллергическое воспаление в легких вносит гораздо больший вклад в развитие гиперреактивности бронхов (ГБР), чем вирусная инфекция дыхательных путей.


Одними из главных участников аллергического воспаления являются провоспалительные клетки, в первую очередь эозинофилы, которые инфильтрируют ткань легких и в результате дегрануляции высвобождают медиаторы воспаления. Респираторно-синцитиальная вирусная (РСВ) инфекция также сопровождается рекрутированием ряда иммунных клеток в участок воспаления (ткань легких), таких как лимфоциты, дендритные клетки, макрофаги. При этом развитие РСВ-инфекции дыхательных путей на фоне текущего аллергического воспаления приводит к инфильтрации как эозинофилами, так и лимфоцитами с макрофагами, что подтверждено в данной работе результатами гистологического исследования тканей легких. При моделировании экспериментальной БА (1-я группа) в ткани легких преимущественно детектировались эозинофилы, при респираторно-синцитиальный вирусной (РСВ) инфекции - лимфоциты и макрофаги, в то время как у животных 2-й группы, подвергшихся моделированию РСВ-индуцированных осложнений бронхиальной астмы, происходила инфильтрация как эозинофилами, так и лимфоцитами (см. рис. 4 А).

Известно, что в патогенезе бронхиальной астмы активное участие принимают Th2-клетки, которые продуцируют так называемые Th2-цитокины (IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13), экспрессия которых регулируется одним из факторов транскрипции - GATA3. Ключевым в индукции аллергии считают IL-4, который активирует синтез антител изотипа IgE, способствует поступлению провоспалительных клеток, в частности эозинофилов, в ткань легких и формированию гиперреактивности бронхов (ГБР). РСВ-инфекция дыхательных путей, наоборот, приводит к индукции Th1-имунного ответа и к поляризации Th0-лимфоцитов в Th1-лимфоциты, продуцирующих IFN-y, экспрессия которого регулируется транскрипционным фактором T-bet.

С использованием на мышах модели РСВ-индуцированных осложнений бронхиальной астмы и количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) мы изучили локальный (в ткани легких) Th1/Th2-баланс иммунного ответа. Как ожидалось, в 1-й группе, подвергшейся моделированию БА, в легких зафиксирована повышенная экспрессия IL-4 и GATA3 (повышение в 1,5 и 1,6 раза в сравнении с интактными) (см. рис. 5 А, Г). В группе 3, в которой животные получали только респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), наблюдалось повышение уровня экспрессии IFN-y и T-bet в 2,1 и 2 раза по сравнению с интактными животными (см. рис. 5 Б, В). При этом у животных 2-й группы, которые на фоне сенсибилизации к аллергену были инфицированы РСВ, уровень экспрессии маркеров Th2-имунного ответа (IL-4 и GATA3) продолжал оставаться повышенным и не отличался от значений 1-й группы, подвергшейся моделированию БА (см. рис. 5 А, Г). Однако экспрессия IFN-y и T-bet имела явную тенденцию к увеличению в сравнении с 3-й группой, которая получала только респираторно-синцитиальная вирус, хотя это увеличение не было статистически значимым (см. рис. 5 Б, В). Эти данные свидетельствуют о сдвиге Th1/Th2-баланса в сторону Th1-иммунного ответа у животных, инфицированных РСВ, на фоне сенсибилизации к аллергену.


В исследованиях на сходных экспериментальных моделях у мышей показано, что респираторно-синцитиальная вирусная (РСВ) инфекция не только вызывает повышенный уровень Th1-имунного ответа (IFN-y в ткани легких), но и усиливает экспрессию Th2-цитокина (IL-4 в ткани легких).

Полученные нами результаты отличаются от данных приведенных ранее исследований поскольку мы не обнаружили усиления экспрессии IL-4 при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции. Возможно, это связано с отличием в протоколе введения OVA для индукции сенсибилизации (аэрозольный и внутрибрюшинный, без использования адъюванта). Исследования Лю с коллегами показали, что респираторно-синцитиальная вирусная (РСВ) инфекция до сенсибилизации аллергеном приводила к протекции от последующего развития фенотипа бронхиальной астмы (снижение IL-4 в легких и IgE в сыворотке крови), однако РСВ-инфекция после сенсибилизации не оказывала значительного влияния на уровень Th2-ответа. Наше исследование подтвердило результаты, полученные Лю с коллегами, показав, что экспрессия IL-4 и GATA3 не снижалась после РСВ-инфекции сенсибилизированных мышей.

Таким образом, проведенное исследование на модели респираторно-синцитиального вируса индуцированного осложнением бронхиальной астмы, воспроизведенной на мышах, показало, что РСВ-инфекция на фоне сенсибилизации к аллергену не вызывает усиления Th2-имунного ответа, но при этом происходит, наоборот, усиление Th1-ответа, что в итоге сдвигает Th1/Th2-баланс в сторону Th1.

© А.Р. Гайсина, И.П. Шиловский, А.А. Никонова, М.С. Сундукова, М.А. Зарецкая, В.В. Смирнов, О.Ю. Камышников, А.С. Иванова, М.Р. Хаитов.